试验设计
图1 试验设计
菌根植物从土壤中获取磷的途径分为直接途径和菌根途径，研究表明，菌根途径对植物吸收磷的贡献受多种生物因素的影响，例如，植物物种、AM真菌物种和土壤微生物等。AM真菌存在着广泛的遗传变异，这可能导致了AM真菌生物学功能的多样性。对同一AM真菌物种而言，不同生态型在获取和活化土壤磷的能力上是否存在差异目前尚不清楚，因此本研究以2个为R.irregularis生态型和玉米Oh 43为生物材料，研究了在有效磷水平低、中、高的土壤中，不同AM真菌生态型对植物磷吸收的影响。我们假设：（1）不同AM真菌生态型在不同磷水平下对植株磷营养的影响不同；（2）不同AM真菌生态型对磷吸收能力的作用机制不同。
供试玉米品种为“oh 43”，土壤经γ射线灭菌。
本试验为双因素随机区组设计：因素一：分别将土壤Olsen-P含量调节到P1（10.3 mg kg-1）, P2（18.6 mg kg-1），P3（43.8 mg kg-1）；因素二：不接种或接种Rhizophagus irregularis 41833或Rhizophagus irregularis 43194。土壤添加100 mg kg-1 P （phytin），接种5 mL细菌滤液。
结果
1.地上部生物量、地上部磷含量和菌根侵染率
在18.6 mg kg-1有效磷条件下，接种MUCL 43194和MUCL 41833可显著（P≤0.05）提高植株的地上部生物量，但在10.3或43.8 mg kg-1的土壤有效磷水平上没有显著差异（图1a）。当土壤有效磷分别为10.3和18.6 mg kg-1时，接种MUCL 43194处理的地上部磷含量显著（P≤0.05）高于未接种处理，但当土壤有效磷水平为43.8 mg kg-1时，两者差异不显著（图1b）。MUCL 41833和MUCL 43194处理的地上部生物量和地上部磷含量差异不显著。MUCL 41833或MUCL 43194接种的植物，在三个磷水平下菌根侵染率不同（图1c）。接种MUCL 41833在土壤速效磷浓度为10.3、18.6和43.8 mg kg-1时，菌根侵染率分别为66.96%、46.73%和5.36%。接种MUCL 43194在土壤有效磷浓度为10.3、18.6和43.8 mg kg-1时，菌根侵染率分别为67.56%、73.51%和8.17%。在土壤有效磷浓度为18.6 mg kg-1时，接种MUCL 43194的玉米根系侵染率显著（P≤0.05）高于接种MUCL 41833的处理。而MUCL 43194和MUCL 41833在土壤有效磷浓度分别为10.3和43.8 mg kg-1时，玉米根系侵染无显著显著。
图1（a） 地上部生物量，（b）地上部磷含量和（c）菌根侵染率
2.植物磷酸盐转运基因的相对表达
土壤有效磷水平显著影响植物直接吸磷途径的磷酸盐转运基因ZmPHT1;1和ZmPHT1;2和菌根吸磷途径的磷酸盐转运基因ZmPHT1;6的相对表达（图2）。在土壤有效磷浓度为10.3 mg kg-1时，接种AM真菌的处理ZmPHT1;1和ZmPHT1;6的表达量均显著（P≤0.05）上调。在18.6 mg kg-1土壤有效磷水平下，接种MUCL 41833后，ZmPHT1;6的表达量显著上调（P≤0.05），而ZmPHT1;1和ZmPHT1;2的相对表达量未显著上调。与不接种处理相比，R. irregularis MUCL 41833诱导ZmPHT1;6表达量高于R. irregularis MUCL 43194。在 43.8 mg kg-1土壤有效磷下，接种AM真菌处理显著（P≤0.05）下调了ZmPHT1; 1的表达。
图2 参与植物磷酸盐转运基因的相对表达：（a）ZmPHT1;1（b）ZmPHT1;2和（c）ZmPHT1;6.
3.非根际土壤菌丝密度和速效磷
当植物在没有接种AM真菌时，在非根际土壤中仍然检测到小的菌丝密度，这可能是由于土壤中的原始菌丝没有降解。接种MUCL 41833处理的非根际土壤菌丝密度在10.3和18.6 mg kg-1土壤有效磷时显著（P≤0.05）高于R. irregularis, MUCL 43194，而43.8 mg kg-1土壤有效磷时，两个R. irregularis生态型之间没有显着差异。接种MUCL 41833处理的非根际土壤菌丝密度最高为10.3 mg kg-1土壤有效磷的处理有效磷，其次为18.6 mg kg-1土壤有效磷，最低为43.8 mg kg-1土壤有效磷。接种MUCL 43194处理的非根际土壤菌丝密度在10.3和18.6 mg kg-1土壤有效磷大于 43.8 mg kg-1土壤有效磷。当土壤有效磷水平为18.6 mg kg-1时，接种AM真菌处理土壤Olsen P含量显著（P≤0.05）降低，但在10.3 mg kg-1和43.8 mg kg-1土壤有效磷水平上差异不显著（图3b）。
图3 （a）菌丝密度和（b）土壤有效磷含量
4.根际土壤速效有机磷和碱性磷酸酶活性
根际土壤的速效有机磷含量和ALP活性受土壤有效磷水平的显著影响（图4）。在土壤有效磷水平为18.6 mg kg-1时，接种MUCL 43194处理的根际土壤速效有机磷含量显著（P≤0.05）低于未接种处理，而其他土壤有效磷水平无显著差异（图4a）。不接种处理和接种MUCL 41833处理的根际土壤碱性磷酸酶活性随着土壤有效磷的增加而显著降低（图4b）。在土壤有效磷水平为18.6 mg kg-1时，接种MUCL 43194处理的根际土壤碱性磷酸酶活性显著（P≤0.05）高于接种MUCL 41833处理有效磷，而AM真菌处理在土壤有效磷水平10.3和43.8 mg kg-1时差异不显著。
图4 土壤（a）速效有机磷和（b）碱性磷酸酶活性
5. 细菌16S rRNA基因拷贝数、α多样性指数和群落组成
未接种处理与接种MUCL 41833或MUCL 43194处理的16S rRNA基因拷贝数无显著差异（表1）。在18.6和43.8 mg kg-1有效磷的土壤中，接种MUCL 41833，Chao 1指数显著降低（P≤0.05）。
表1 16S rRNA gene copy number and Chao 1指数
细菌在OTU水平上的韦恩图显示了不同处理之间共有或特有的OTU数量的差异（图5）。3种土壤有效磷水平下，未接种处理特有OTUs数量均最大。在土壤有效磷含量为10.3 mg kg-1时，接种MUCL 43194处理和不接种处理共有720个相同的OTUs，接种MUCL 41833处理和不接种处理共有500个相同的OTUs（图5a）。在土壤有效磷浓度为18.6 mg kg-1时，接种MUCL 43194处理与不接种处理共有750个OTUs，接种MUCL 41833处理与不接种处理共有471个OTUs（图5b）。在土壤有效磷浓度为43.8 mg kg-1时，接种MUCL 43194处理和不接种MUCL 43194处理共有695个相同的OTUs，接种MUCL 41833处理和不接种处理共有516个相同的OTUs（图5c）。此外，在3种土壤有效磷水平上，接种MUCL 43194的处理均比接种MUCL 43194的处理具多的特有OTUs。
图5不同处理基于OTU的韦恩图
不同细菌门的相对丰度直方图显示，Proteobacteria和Chloroflexi最丰富，其次是Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Acidobacteria、Planctomycetes、Firmicutes和Thaumarchaeota（图S1）。在门水平上，接种MUCL 43194比接种MUCL 41833时Proteobacteria的相对丰度显著增加（图S1）。此外，在目水平上，相对丰度的弦图显示了3个土壤有效磷水平上不同处理的物种组成（图6）。在目水平上，Betaproteobacteriales相对丰度最多，其次是Proteobacteria, Rhizobiales, Gemmatimonadales, Cytophagales, Thermomicrobiales, Sphingomonadales, Caulobacterales, Myxococcales, Nitrososphaerales and Bacillales。与接种MUCL 41833处理相比，接种MUCL 43194处理的Betaproteobacteriales的相对丰度分别从21.1%提高到26.7%、9.1%~18.6%和8.8%~15.8%。
图6不同磷水平下土壤细菌的物种组成
6.目水平上相对丰度top9的细菌与碱性磷酸酶活性的相关性
在目水平上，7种细菌的相对丰度与根际ALP活性呈显著（P≤0.05）的线性相关。在这些细菌中，前9个目中只有Betaproteobacteriales的相对丰度与ALP活性呈正相关（图7a）。Gemmatimonadales、Rhizobiales、Myxococcales、cytohagales、Nitrososphaerales和Thermomicrobiales的相对丰度与ALP活性呈显著负相关（图7c, d, e, f, g, i）。Caulobacterales和Sphingomonadales与ALP活性之间无显著相关性（图7b, h）。此外，分析了3种土壤有效磷水平下土壤Olsen P含量与ALP活性的相关性(图S2)。在18.6 mg kg-1速效磷水平下，土壤Olsen P和ALP活性呈显著正相关（R2= 0.77, P = 0.002）。
图7目水平上物种的相对丰度与土壤碱性磷酸酶的相关性
7.土壤细菌共生网络
基于非接种处理和接种2个不同菌株的不同OTUs之间的Spearman相关性，在3个土壤有效磷水平上建立了3个共生网络（图8）。接种R. irregularis MUCL 43194处理的共发生网络结构最复杂。尽管节点数相似，接种MUCL 43194（1434）的处理构建的网络连接数量最大，大于非接种处理（1097）和接种MUCL 41833（999）构建的网络连接数量（表2）。接种MUCL 43194处理的正相关比例（86.12%）高于未接种处理（57.34%）和接种R. irregularis霉MUCL 41833处理（60.96%）（表2）。每个网络都包含一组独特的keystone（图8）。MUCL 41833接种处理的根际主要keystone细菌分为uncultured (OTU_246), Deinococcales (OTU_381), Propionibacteriales (OTU_2120), Nitrososphaerales (OTU_3443), Betaproteobacteriales (OTU_37) ，unclassified_Gammaproteobacteria (OTU_51)，接种MUCL 43194的处理中keystone为Rhizobiales (OTU_466 and OTU_93)， Thermomicrobiales (OTU_44)， Gaiellales (OTU_146, OTU_96 and OTU_108)， Cytophagales (OTU_6)， Nitrososphaerales (OTU_23) and Myxococcales (OTU_35) (Table S2)。另外，接种MUCL 43194的处理与未接种处理和接种MUCL 41833的处理相比，keystone连接数最大（表S2）。
图8不同处理的共生网络(a) No-AMF, (b) RI 41833 and (c) RI 43194
讨论
丛枝菌根真菌在植物磷吸收中起着重要作用，且在物种水平上存在较大的遗传变异。然而，在不同土壤有效磷水平下，同种AM真菌的不同生态型如何影响植物磷利用效率目前还不清楚。本研究发现，在土壤有效磷水平适中的条件下，2个AM真菌的不同生态型采取不同的策略提高植物磷含量。R. irregularis MUCL 41833产生大量的根外菌丝有利于磷的吸收，而R. irregularis MUCL 43194与R. irregularis MUCL 41833相比，形成了不同的根际细菌群落，该群落含有与碱性磷酸酶活性密切相关的物种，因此具有提高有机磷矿化的潜力。
1 .在中等土壤有效磷水平下，2种R. irregularis生态型对提高植物磷素吸收有不同的策略
植物的根通常被不同种类的AM真菌侵染，先前的研究表明AM真菌的磷获取策略存在差异，然而，这种变异是否存在于同一AM真菌种的不同生态型之间尚不清楚。在中等土壤有效磷水平下，两种AM真菌生态型均增加了玉米地上部生物量。这些结果与以往的研究一致，即在土壤有效磷水平中等时，菌根对植物的贡献通常最显著，这取决于在不同土壤有效磷水平下，菌根对直接或直接途径的偏好。在土壤有效磷水平较低时，玉米产生羧酸盐和酶来活化土壤磷素，而在土壤有效磷水平较高时，玉米生长更多的根来直接从土壤中吸收磷。在中等土壤有效磷条件下，玉米将大量碳投入AM真菌以从菌根途径中获取磷，这可能是一种更经济的以碳换磷的策略。虽然这两种AM真菌对玉米地上部磷含量的影响没有显著差异，但两种AM真菌生态型分别通过增加无机磷的吸收范围和增强土壤有机磷的活化来提高植株对磷的吸收，它们可以通过不同的策略增加植物对磷的吸收。首先，菌丝密度是反映AM真菌从土壤中获取无机磷能力的最佳指标。在土壤有效磷水平较低时，AM真菌可以生长更多菌丝以获得更多的磷。随着土壤有效磷水平的提高，AM真菌菌丝对磷的吸收效率提高，菌丝可以获得大量的磷传递给植物。本研究中，在低、中土壤有效磷水平下，R. irregularis MUCL 41833与R. irregularis MUCL 43194相比，具有较大的菌丝密度。
有趣的是，在R. irregularis MUCL 41833侵染的根中，参与菌根途径的转运蛋白ZmPT1;6的表达量也更大。而在土壤有效磷水平较低的情况下，与直接途径相关的转运基因ZmPT1;2在R. irregularis MUCL 43194定殖的根系中表达量高于R. irregularis MUCL 41833定殖的根系。这些结果表明，R. irregularis MUCL 41833可能通过根外菌丝向植物细胞传递更多的磷。其次，ALP活性可以反映AM真菌促进土壤微生物对有机磷的活化能力。在中等土壤有效磷水平下，R. irregularis MUCL 43194的碱性磷酸酶活性显著（P≤0.05）高于R. irregularis MUCL 41833。相应地，接种R. irregularis MUCL 43194处理速效有机磷含量下降幅度较大。以往的研究主要集中在不同种或单一种AM真菌接种对磷酸酶活性的影响来研究有机磷的活化，忽略了同一种AM真菌的不同生态型的比较。这些结果表明，不同生态型的AM真菌可能具有不同的促进植物吸收磷的机制，增加了植物、AM真菌和根际微生物系统对缺磷的响应的复杂性。
2.两种R. irregularis生态型形成了不同的根际细菌群落
Rhizophagus irregularis MUCL 43194可能通过提高细菌数量或改变细菌群落的结构来提高ALP活性。在以往的研究中，接种Glomus mosseae可使根际细菌数量增加。然而，在本研究中，细菌数量的16S rRNA基因拷贝数在两种R. irregularis生态型的存在下并没有显著增加（P≤0.05）。这表明细菌数量不是ALP活性增强的驱动因素。因此，被认为是影响磷酸酶活性的潜在因素的细菌群落组成仍然是主要因素。与未接种处理相比，接种AM真菌处理的根际细菌Chao1指数或多样性降低，尤其是在中等土壤有效磷水平。这种多样性的变化与AM真菌对细菌的选择性招募有关。两种菌株接种的Chao1指数无显著差异。但在OTU水平上，接种R. irregularis MUCL 43194处理的OTU与接种R. irregularis MUCL 41833处理的OTU差异较大。此外，在中等土壤有效磷水平上，R. irregularis MUCL 43194侵染植株的菌根侵染率大于R. irregularis MUCL 41833，有利于菌根途径对磷的吸收。上述结果表明，R. irregularis MUCL 43194所选择的细菌群落可能具有提高土壤碱性磷酸酶活性的能力。
最近的研究表明， R. intraradices和Gigaspora margarita，Funneliformis mosseae和G. margarita招募了不同的根系微生物群落，并影响了根系ALP活性。然而，很少有证据表明相同AM真菌的不同生态型对根际微生物群落的形成有不同的影响。在本研究中，我们发现R. irregularis MUCL 43194与R. irregularis MUCL 41833相比，在门水平上，Proteobacteria的相对丰度与ALP活性呈正相关。然后，我们发现在目水平上接种R. irregularis MUCL 43194后，属于Proteobacteria的Betaproteobacteriales的相对丰度增加。比较相对丰度top9的物种与ALP活性的相关性，结果显示只有Betaproteobacteriales与ALP活性呈显著正相关。此外，在共发生的网络中，两种R. irregularis生态型具有不同的网络结构（图8）。我们发现，相对于非接种和接种R. irregularis MUCL 41833处理，R. irregularis MUCL 43194处理构建的共现网络的平均节点度和细菌连接数量最大，这表明，R. irregularis MUCL 43194处理的根际细菌成员间的联系显著增加(P ≤0.05)。这一结果可能表明，在R. irregularis MUCL 43194处理中，细菌群落内部发生了复杂的相互作用来活化土壤中的有机磷。然后我们研究了关键菌与被R. irregularis MUCL 43194富集的Betaproteobacteriales之间的联系。我们发现所有的关键细菌都不属于Betaproteobacteriales，这表明根际的关键细菌是保守的。其中，Betaproteobacteriales是根际细菌的优势目，可能在有机磷矿化过程中起重要作用。虽然它不能维持网络中相对于其他类群的网络结构。以上结果表明，AM真菌影响根际细菌群落组成，这种差异也与AM真菌的生态型有关。
3.不同菌株对根际细菌群落的影响
植物根际的细菌群落可能受到AM真菌分泌物和根分泌物的影响。AM真菌的分泌物是影响土壤微生物群落结构的关键因素，已有研究表明，几种不同的AM真菌都有其与菌丝分泌物相关的特定微生物群落。对AM真菌R.irregularis MUCL 43194和其他生态型进行全基因组测序后发现所有生态型均存在显著的基因组变异，发现了大量生态型特异性基因、基因家族扩张和分离株间遗传交换的证据。这些研究表明，为了适应不同的生态环境，R. irregularis生态型在基因组表达和转录水平上的代谢过程可能存在差异。因此，不同AM真菌生态型可能释放不同的菌丝分泌物，从而影响根际细菌群落。其次，AM真菌可能影响植物根系分泌物，以形成根际细菌群落。有证据表明，棉花或西瓜根系分泌物的系统性修饰将通过诱导AM真菌来实现。方差和主成分分析结果表明，接种Funneliformis mosseae的植物降低了根系分泌物中的有机酸，如草酸、丙二酸、延胡索酸、苹果酸和T-乌头酸。最近的一项研究发现，R. irregularis分离株的遗传变异驱动了与糖酵解、脂肪酸生物合成和转运途径启动相关的基因转录变化的调控，这揭示了AM真菌在转录水平上对植物根系代谢的潜在调控。
结论
综上所述，我们量化了两种AM真菌生态型在不同土壤有效磷水平中对玉米生长和细菌群落结构的影响。结果表明，同种AM真菌的不同生态型提高植株磷吸收的机制不同。我们发现R. irregularis MUCL 41833具有更大的菌丝密度，这可以扩大根系吸收养分的范围，获得更多的土壤无机磷。同时，玉米根系增加了菌根特异性磷转运基因的转录，更好地实现了共生界面的物质交换。而R. irregularis MUCL 43194则通过调节根际细菌群落结构，提高土壤有机磷矿化。我们的结果表明，R. irregularis MUCL 43194招募了更多的Betaproteobacteriales，这可能导致根际土壤ALP活性的显著提高。综上所述，我们的研究表明，在不同土壤中，R. irregularis的生态型可以通过不同的方式促进植物生长和根际细菌群落的形成，这些发现意味着通过发挥菌根真菌和土壤微生物互作的生物学潜能促进农业可持续发展具有一定的可行性。例如，在在磷储量较少的土壤上可以扩大磷的吸收范围，而在有机磷累积的土壤中，可以提高对有机磷的活化和吸收。因此，需要进一步探讨这些不同策略的影响及其表现的机制。作物、土壤和气候的多样性有可能影响AM真菌在农业生态系统中的功能，我们需要考虑AM真菌种内异质性在农业生产中的多重功能。我们的结果表明，在不同的土壤和气候条件下，挖掘AM真菌不同生态型的潜力对于提高土壤肥力和养分利用效率是可行的。
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